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双光子荧光 粘度探针及其活细胞成像分析

归档日期:08-06       文本归类:发射方式      文章编辑:爱尚语录

  山东大学硕士学位论文Abstract SinceDenk developed two-photon fluorescencethree —dimensional imaging technique,Ilumerousresearcheson two—photonbioimaging oflivecellsandtissues have been being carried out.Compared谢tll conventional light microscope, fluorescence microscope laserscanning confocal microscope,two-photon fluorescence microscope has manyadvantagessuch舔higherspatialresolution.deeper penetrationdepth,lowertissueautofluorescenceandless photodamage.Two—photon fluorescence microscoperequires fluorescent probes have largertwo—photon excited fluorescenceactioncross section(函占),that isan important differencewithcommon orconfocal microscope.Howeverthe relative laggard reaearchworkon two—photon biofluorescence probes restrictsthe application two-photonfluorescence microscope thedetectionandimaging livingcells andtissues.Therefore,itis greatimportance developtwo-photnbiofluorescence probes large参6.Nowthe development two—photonbiofluorescence probes hasbecomean intemationalconcem. Thevalueof microviscosity indifferent compartments ofcellsisdifferent.The valueof cytoplasmviscosity isl一2 cp,very closetothatof waterwhile thevalueof microviscosity neartheintracellularmembrane system Callbe up to140 cp.Intracellular viscositystrongly imquencesintracellular transportation ofmassand signal,interactions between biomacromolecules,and diffusionofreactivemetabolites,For example,the changes cytoplasmviscositymayaffectthe biologicalactivity ofthe myocardial cells increasingofthe viscosity ofbloodcellmembrane willacceleratethe aging.Therefore,detection microviscosityatthecellularlevelis all important scientific proposition.Although thereare many fluorescent viscosity probes havebeen reported.there israredocumentsaboutfluorescent viscosityprobes whichcouldbe applied livingcells.Thereisno report two-photonfluorescence viscosityprobe thatcould imaging livingcells. 山东大学硕士学位论文 Becausethedistributionoftheprobe’S concentrationwithinthecellsiSunkown andthefluorescent intemsity relatedtotheconcentrationoftheprobe,Fluorescent viscosityprobes,based onthemethord onlybydetecting fluorescence intensitycould only画Veinlages high-viscosityregionsinthe cells,but cannot give intracdlularviscositygradientdistribution。Howevertheratiofluorescenceviscosity probes callnot only eliminate probe loadanddatadistortioncaused byequipments,but alsobeableto give gradientdistributionofthelocal microviscosity. htourresearchworkwe fastfredthat probe AIis two—photonfluorescence viscosityprobe wi出red-emission.Andthenwe also speculate probeA1 single-photonratiofluorescence viscosityprobe,according tothe experimental theoreticalanalysis.Based onthe analysis two—photonfluorescent property probeA1,we furthercome up withtheideathat probe A1couldtobea two-photon ratioof fluorescence viscosityprobe. In additionin viewof physiological functionsandtherolesof homocysteine vivo,forexample,plasmahomocysteineexcess may induce many cardiovascular diseases,we alsofredthat probe A7could specially identificate homocysteine DMSOandthattheinteractionofprobe A7with Hey incosolvent DMSO—PBS(v/v8:2) couldbeobserved thenakedeye. Keywords:two-photonfluorescence,viscosity probe,two-photon fluorescence microscopemlagingtechnique,homocystcineprobe 山东大学硕士学位论文 引言 第一章绪论 活性生物组织与细胞及其内部物质纵深方向的大深度、高精度的断层荧光探 测和成像,是医学与生命科学领域面临的挑战性课题。而双光子荧光探测和成像 技术的出现则为解决这些闯题带来了希望。但是由于传统荧光探针的双光子荧光 活性吸收截面偏小,因而所用激发光的光强偏大,容易造成生物样品的热损伤, 从而限制了双光子荧光显微技术的应用。荧光显微探测技术与荧光探针是相互依 存互相促进的:新的荧光技术需要新的探针而新的探针将使探测技术更加完善。 因此,发展高效的双光子生物荧光探针是一个重要的科学命题。 细胞内微环境粘度的改变可能会诱发各种疾病或导致生理功能紊乱,例如, 细胞质内液体的粘度关系着心肌细胞和肺巨噬细胞的活性。近年来在细胞水平上 检测微环境的粘度成为一个研究热点,这对人们认知很多疾病具有重大意义。目 前虽然有许多基于分子转子的荧光粘度探针被报道,但能够实现细胞特别是活细 胞成像的粘度探针还比较少,而能够实现活细胞成像的双光子荧光粘度探针尚未 见报道。因此,利用双光子生物荧光显微技术对活细胞内粘度进行成像具有迫切 性和重要性。 结合双光子荧光技术在生物成像方面的优势(观测深度大、图像清晰、对细胞 或组织损伤小等),我们设计并合成出了具有双光子性能的、具有较大斯托克斯位 移的、发射红光的且能够用于活细胞成像的双光子荧光粘度探针。 1.1双光子吸收理论与双光子生物荧光显微技术 1.1.1双光子吸收理论简介 通常人们所说的单光子吸收是指利用紫外或可见光激发荧光分子时,只有吸 收光子的能量与荧光分子的基态和激发态之间的能带隙相匹配时才会发生电子跃 山东大学硕士学位论文 迁【1l(如图1.1a)。1931年GijppemMayer首次提出了双光子吸收理论【2】。在强激光激 发下,利用两倍或近两倍于样品的线性吸收波长的光源来激发分子,并使分子吸 收两个具有相同或不同频率的光子后再跃迁到高能态,然后分子再回到基态所辐 射出的荧光即双光子荧光,该过程就是所谓的双光子过程(如图1.1b)。在双光子过 程中,因为分子吸收两个较低频率的光子而发射出一个较高频率的光子,亦即长 波激发、短波发射,所以这是一种上转换荧光的过程p】。双光子吸收属于三阶非线 性光学效应,其吸收过程完全不同于单光子吸收过程,而是荧光团与激发光相互 作用的过程【4J。 mortet憎S诚 图l-1.单(a)、双(b)光子吸收和发射示意图1961年Kaiser等‘51在贝尔实验室用脉冲红宝石激光器激发CaF2:Eu2+晶体中 铕离子荧光时首次观察到了双光子激发和双光子吸收现象。后来他们又证明双光 子激发也可以用来激发有机染料而发射荧光。再后来Singh-Bradley还报道了三光 子吸收过程【6】。1990年Dcnk等‘刀人将双光子原理应用到激光扫描共聚焦荧光显微 镜中并创造出双光子激光扫描显微镜,即双光子荧光显微镜。由于在双光子激发 过程中激发波长与发射波长相距甚远,高效滤光片就可以消除激发光。所以在检 测过程中不用小孔光栅就能获得最小限度衰减的信号(图1-2),进而获得更清晰的 图像【引。 山东大学硕士学位论文图1-2单双光子共聚焦显微镜的成像原理及其成像效果图a,争光子;b,双光二f 1.1.2双光子生物荧光显微技术的特点 近年来随着非线性光学的快速发展,以脉冲激光为激发光源的双光子荧光显 微技术已经引起了人们的广泛关注并得到了很好的应用,其原因在于与单光子荧 光显微技术相比,双光予荧光显微技术具有无可比拟的优越性I乳2。】: A)双光子吸收具有高度的空间选择性和分辨率,.日.与入射光强的平方成正 比。由于线性吸收的影响,只有当入射光的峰值光强达到一定阈值才会发生双光 子吸收现象。因此,在紧聚焦激光束照射条件下,双光子效应发生在材料内部相 当于入射光波长的立方的微小区域内,即焦点区域,而存焦点以外的区域入射光 的光强则可以被限控在激发阈值以下,也就刁<会发生双光子吸收。 B)双光子激发光源具有较大的穿透深度,适用于生物样品。双光子过程所用 的激发光波长一股位于600.1000nm,显然其光子的能量要远远低于单光子过程 中紫外辐照光(波长位于250—400rim)光子的能量。众所周知,近红外光对生物 样品具有较好的穿透能力,所以双光子吸收过程所用的激发光对生物样品的光损 伤较小,还可以解决生物组织中深层物质的成像问题,同时很好地避免了对生物 样品的漂白、降解及光致毒等问题,也能够避免生物样本自发荧光(自发荧光物质 山东大学硕士学位论文的激发波长一般都在350.560nnl的范围内)的干扰。 C)由于瑞利散射所产生的背景噪声小, 因此图像对比度高且能够给出细胞 生理活动的三维信息。 D)激发光与信号光的波长差别显著,易于滤波探测。 大量实验证明,在脉冲激光的激发下,具有较大的冗电子共轭体系或较大的跃 迁偶极距的有机分子能够同时吸收两个光子使其前线轨道的电子跃迁到高能级, 从而发生双光子吸收过程。目前已经报道了很多有机双光子生物荧光探针。通过 增大分子的共轭体系、改变结构中推拉电子基团的电子供给能力或者改变与靶标 特异性结合的识别基元,借助适当的有机化学合成反应,就可以制各出更多性能 较好的双光子生物荧光探针。另外,在分子中引入醚、羟基、离子等水溶性基团 可以增加探针分子的水溶性;而在分子中引入酯,烷基链等基团则会增加探针的 1.1.3双光子生物荧光探针概述随着双光子荧光显微镜的问世和发展,人们逐渐开发了很多具有特定用途的 双光子生物荧光探针。这些探针122-27j主要有以下类型:双光子核酸(DNA或RNA) 探针、双光子pH值探针、双光子离子(Ca2+、M92+、Zn2+、pb2+、H92+、Na+、n 探针、双光子脂质筏探针、双光子氨基酸(半胱氨酸/高半胱氨酸)探针、双光子线 粒体探针、双光子囊泡探针、双光子内质网探针、双光子膜探针等。 2008年PicotA.等f28I报道了第一个用于双光子荧光显微成像的镧系配合物。他 们所设计的配合物具有良好的水溶性和较高的稳定性,而且能够发射较强的红光, 具有较长的荧光发射寿命和较大的双光子吸收截面。同时他们认为这类配合物是 新一代的荧光分子探针。 2009年TianYS.等129】设计并报道了一种新的双光子追踪剂AG2。借助于葡萄 糖的专一置换AG2很容易被癌细胞或癌组织吸收。 AG2具有毒性低和光稳定性高 等优点,而且不受生理范围pH值(pH=4.0-10)的影响。另外,AG2能够监控患者体 内病灶的葡萄糖吸收状况,而且在双光子荧光显微镜下还可以监测抗癌药物在癌 细胞或癌组织中的功效。 山东大学硕士学位论文1.1.4双光子生物荧光探针所面临的问题 诚然,双光子荧光探针以及双光子荧光显微成像技术在生命科学与医药领域 具有很好的应用前景和发展潜力。由于单光子过程与双光子过程遵循4i同的选律, 当单光子荧光探针被用作双光子荧光探针时,其双光子诱导荧光量子产率则会偏 低,且其双光子荧光活性吸收截面也较小。如果用传统的染料荧光素或罗丹明来 进行双光子性能研究,则研究过程中大部分激发光的能量以热量的形式散失而对 生物样品造成较大的光损伤,这也就限制了双光子荧光显微技术的应用【201。虽然 目前已经有一些双光子荧光探针被报道了,但是具有某一特定用途的双光子生物 荧光探针还比较缺乏。而且现有的双光子生物荧光探针还具有很多缺陷,比如双 光子荧光活性吸收截面小,或荧光量子产率低,或识别响应灵敏度低,或生物样 品的相容性差,或活细胞、活组织的穿透性差等。因此,在设计合成性能优良的 双光子生物荧光探针时需要避免以上缺点。 1.1.5近年来课题组在双光子生物荧光探针领域的成果 3双光了荧光显微镜实物(左)和工作原理示意图(右)经过多年彳i懈的努力,我们课题组自主成功地搭建-Sx2光子荧光显微镜(如图 1—3)。双光子荧光采用Ti:sapphireMira900一F锁模激光器发出的激光脉冲作为辐照 光源,其重复频率为76MHz,脉冲宽度为200fs,并采用SpectroPr0300i光谱仪作 记录。 山东大学硕士学位论文基于此,我们课题组进行了大量的相关研究工作,开发了一系列双光子生物 荧光探针,并得到国内外同行的认可。相关成果发表在影响力较大的期刊上【30-351。 A)双光子核酸探针 张元红师姐【321报道了以咔唑为母体的正阳离子盐化合物,通过体外测试证明 了这类化合物对DNA具有很好的专一识别性,并研究了这类分子探针与DNA结 合的几种方式(如图1-4)。她认为在DNA浓度较大时,探针分子主要通过静电作 用、氢键作用和范德华力以沟槽方式结合在DNA双链的外部。其中9E.BHVC具 有较大的双光子活性吸收截面,并能和DAPI实现较好的复染,也成功进行了植 物活组织的双光子荧光成像。该成果发表在2010年Organic&Biomolecular Chemistry上。 图!-4DNA探针9E.BHVC的结构式(上)与其染色后HeLa细胞的细胞成像(下)a:9E-BHVC图像。b:DAPI图像。c:a和b的图像叠加 山东大学硕士学位论文 刘鑫师姐【3l】于2011年报道了一个RNA探针(如图1.5)。该探针分子和 9E.BHVC是同分异构体。存体外测试中,该分子对RNA和DNA的结合能力几 乎没有差别。然而,反复的细胞成像实验表明,该探针能够识别细胞核核仁区和 细胞内的RNA,并且成功地实现了与DAPI的复染。遗憾的是,她没有给出关于 该探针与RNA之间作用机制的确切解释。 5RNA探针的结构式(上)与经27—9EBHVC染色HeLa细胞的双光了荧光成像(下), c中白色线E—BHVC图像。b:DAPI图像。c:a和b的图像叠加 B)双光子线粒体探针 刘鑫师姐嘲还成功报道了一系列咔唑正阳离子化合物(如图1.6和1.7)。这些 化合物刁i但具有大的双光子吸收截面,而且在双光子荧光显微镜下实现了对线粒 体的定位检测,并成功地与商业化的线粒体探针MTO进行复染。该成果于2011 年发表在JournalofFluorescence上。 图I-6线粒体探针的结构式 山东大学硕士学位论文图1.7经9B-HVC染色后的SiHa细胞的荧光图像 a'-宽场图像b:双光予图像c:DIC图像d:b和c的叠加 C)双光子半胱氨酸探针 2012年杨志广师兄【3郇报道了两个特异性识别活细胞内半胱氨酸的探针AMI 和CAl,成功地将半胱氨酸和高半胱氨酸区分开,并进行了双光子活细胞成像研 究(如图1.8)。它们分别发射红光和蓝光,这对细胞或组织的多光谱成像研究意义 非凡。该成果发表在ChemCornm上。 图1.8半胱氨酸探针的结构式(上)经AMl和CAl染色的HeL瑚胞的图像(下),IIC中灰色线微米,a:双光了图像b:DIC图像c:a和b的图像叠加I>565nm11510-540nnl 山东大学硕士学位论文1.2生理粘度与荧光粘度探针 1.2.1生理粘度的功能与作用 从细胞生物力学的角度来看,细胞的结构可大致区分为细胞膜、细胞骨架和 细胞质136】。其中,细胞骨架被公认为是具有一定刚性的框架,而细胞质和细胞膜 则具有一定的粘弹特性,并且当细胞处于疾病状态时,这种粘弹特性就会发生变 化”7J。而粘度就是衡量这种粘弹特性的一个重要参量。细胞内不同区域的粘度值 也有很大差别。例如,SKOV-3细胞中胞质液的粘度值和水的粘度值很接近,约 为1.2cp;而其囊泡的粘度值则是胞质液粘度值的100多倍。细胞内膜系统附近 的粘度值则可能达到140cp甚至更高口“11。人体表皮细胞的膜粘度大约在30.100 cpl42】而肝细胞的膜粘度大约在108—217cp[431。不同区域的粘度在生物系统内都起 着各自非常重要的作用m,451,而不同区域的粘度值的变化就会引起相应的生理功 能的改变或疾病的发生。 细胞膜粘度的变化跟细胞内很多生理过程的改变有关。这种变化不仅能够直 接影响膜结合蛋白的活性1461,而且还预示着这些蛋白质的含量会与正常值有差 异。由于蛋白质是很多酶促反应的关键物质,细胞膜粘度的变化很可能会导致多 种疾病的发生。这些疾病包括动脉硬化,细胞恶性肿瘤,血胆脂醇过多和糖尿病 等【47】。研究表明,糖尿病人血红细胞和血小板膜粘度的增加会导致胰岛素不能聚 合。肝病患者红细胞膜粘度比正常人的高出很多,而这正是肝功能障碍的病因。 另外,白细胞膜粘度的增加还会加速衰老14引。 由于检测方法的局限性,关于细胞质粘度的研究还不太多。已经得到证实的 是f491,细胞质粘度的增加会严重抑制卵母细胞的发育,细胞质粘度的改变还会影 响到肺巨噬细胞的生物活性,此外心肌细胞的正常活性也和细胞质微粘度的变化 密切相关。目前在研究细胞质粘度的工作中,主要是通过磁性颗粒来获得胞质液 的粘弹特性信息,但是这些磁性颗粒的研究需要很昂贵的仪器而且很费时,同时 它们与细胞内微环境的作用还有很大缺点1501。 从系统水平来说,血液的粘度也有很重要的作用。存循环系统中,血液粘度 的分布信息与内皮细胞机械传导的剪应力有关【511。而这种剪应力又跟很多影响血 山东大学硕士学位论文管活性的介质(比如前列环素和一氧化氮)相关,并且调制细胞的凋亡过程1521。 另外,血浆粘度不但调控着血红细胞和肝细胞内的很多生化功能,而且还调节脂 蛋白的新陈代谢。血浆粘度的变化也已被证实与急性心肌梗塞、高血压和糖尿病 等疾病相关1531。血浆粘度的影响因素很岁541,比如,蛋白质诱导引起的高粘度会 导致动脉粥样硬化风险升高。此外吸烟和缺乏锻炼等不良生活习惯也会直接或间 接地导致血浆粘度增加,进而诱发心血管疾病。另据报道[5556],淋巴系统能够将 蛋白质和其它流体释放到血浆或血液中,从而导致血浆或血液中的粘度升高,所 以有研究者对淋巴流体的粘度和疾病的关系做了相应的研究,发现乳腺癌的治疗 与淋巴流体的粘度有关。 1.2.2传统检测粘度的方法 截止目前被开发和利用的检测粘度的方法和仪器有毛细管粘度计,落球粘度 计,旋转粘度计等【3刀。其中毛细管粘度计原理简单、测量精度高,广泛应用于纺 织、化工、国防等行业,它通过测量牛顿液体流经计时起点刻度线与计时重点刻 度线之间的时间差,从而确定牛顿液体的粘度【571。传统的毛细管粘度计工作效率 低而且检测误差较大。旋转式粘度计适用于包括牛顿型流体和非牛顿型流体的所 有流体,测量快速方便准确性高,可以通过调节转速来测量不同剪切率下的流体 粘度。但是这种方法所需的硬件设备多,结构复杂,价格昂贵,也就限制了它们 在实际中的应用。国际血液学标准化委员会【58】推荐测定血浆粘度时利用毛细管粘 度计,但是使用这种方法来检测血浆粘度仍需要500ttL样本,耗费一分钟。同时 在检测过程中血浆中的蛋白质很可能会附着在这些粘度计表面,因而会引入不必 要的测量误差,而且测量过程中很可能会导致生物样品的破坏。总之,这些方法 在应用于小样品或局部粘度的实时检测时就有很大的局限性,但是应用荧光探针 的方法就能够有效地避免这些缺陷,而且具有较高的空间分辨率和时间分辨率, 还可以进行组织或细胞成像丌。 10 山东大学硕士学位论文 1.2.3荧光粘度探针概况 Xr洲 图1.9常见的荧光粘度探针结构举例虽然细胞内粘度的检测受到各方面因素的制约,但是据目前的资料记载(如图 1.9),很多荧光粘度探针被报道了9,矧。 M.A.Haidekker等16IJ报道了一些基于扭转的分子内电荷转移原理(详细分析 见本论文第四章第3小节)的荧光粘度探针,而且他们认为溶剂极性和粘度对探针 的影响是不可分的,其中,溶剂极性使得探针分子的发射峰发生红移而溶剂粘度 使探针的发射峰强度发生显著改变。 大连理工大学杨志刚等【381报道了一个中位醛基取代的五甲川菁染料可以用作 荧光粘度探针。溶剂极性该探针的影响很小可以忽略,而随着环境粘度的逐渐增 加探针分子的荧光强度明显增强。而.17.该探针具有活细胞膜穿透性,在检测活细 胞微环境粘度方面具有潜在的应用价值。 K.Kasatani掣62】研究了一些c),anine染料。在连续的双光子激发条件下,它们 发射出较短波长的荧光,其荧光量子效率主要取决于溶剂粘度而受温度的影响很 小。但是报道中没有给出这些染料的细胞图像。 201 1年大连理工大学的彭孝军等【63】实现了波长为800眦光源激发下的细胞 粘度成像,但是他们没有给出该探针的双光子性能数据。 经过查阅大量关于荧光粘度探针的资料和相关文献,我们了解到,目前虽然有许多荧光粘度探针被报道,但能够实现细胞特别是活细胞成像的粘度探针还比 较少,而能够实现活细胞成像的双光子荧光粘度探针尚未见报道。 1.3双光子生物荧光粘度探针构想 在生命科学研究工作中,能够给出细胞中生理活动的三维信息是非常重要的, 而双光子荧光显微镜恰好在该方面具有较大的优势。与激光扫描共聚焦显微镜相 比,双光子荧光显微镜具有很多优点:对生物样品的光损伤较小、能够有效地避 免生物体的自发荧光、轴向分辨率更高、图像的对比度更高、并延长了活细胞和 组织的监测时间等。由于荧光显微探测技术与荧光探针是互相促进的,所以只有 双光子荧光显微镜与双光子生物荧光探针结合起来,才能发挥它们各自的优势。 但是具有特定用途并能够进行生物成像的双光子荧光探针还比较紧缺,因此研究 具有大的双光子活性吸收截面并能够用于活性生物组织与细胞成像的双光子荧光 探针显得极为重要。 现阶段越来越多的人们忍受着诸如糖尿病、动脉粥样硬化、高血压等各种各 样的心血管疾病或机能失调。往往这些生理上的紊乱或病变都和细胞或组织内流 体特性的改变相关,而粘度是衡量这些流体特性的关键参数。鉴于传统检测粘度 的方法对于微观水平上的粘度检测显得无能为力,而且现有的荧光粘度探针还有 很多缺陷,结合双光子荧光显微技术的特点和双光子生物荧光探针的特点,本论 文中我们开展了双光子荧光粘度探针及其活细胞成像研究方面的工作: A)合成了以三苯胺为母体的,具有红光发射特性、具有良好识别性、能透 过活细胞膜、能进行双光子荧光活细胞粘度成像的双光子荧光粘度探针。 B)通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、高分辨质谱等对合成得到的探针分子 进行了系统的化学结构表征。 C)关于探针对粘度的敏感性进行了详细的研究,并且排除了溶剂极性、pH 值以及核酸、氨基酸与常见离子等因素的干扰。 D)在活细胞中对探针进行了单、双光子荧光显微成像。 12 1.4本章小结 山东大学硕士学位论文 在本章中,主要介绍了双光子生物荧光显微技术的优点,同时对双光子荧光 探针的开发与应用前景作了认真的分析并指出当前双光子荧光探针所面临的问 题。另外,本章还详细介绍了生理粘度的功能与作用,还对荧光粘度探针的研究 现状进行了分析,最后提出了制备双光子生物荧光粘度探针的构想。 参考文献 J.A.Howell,R.E.Sutton,Anal.Chem.,1998,70(12),107—118. 【2】M.G郇pert-MayerAnn.Phys.(Leipzig),1931,只273-294. 【3】I.GGutYHefetzI.E.KochevarZPhys.Chem,,1993,97,5171-5176. 【4】T.C.S.PeterYD.Chen,R.Barryeta1.Annu.Rev.Biomed.Eng.,20062, 399.429. 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